1、基本工作原理

1）吸收的本质：分光光度法是利用物质对不同波长光的选择吸收特性而建立起

来的分析方法。通常利用棱镜或光栅分光来取得单色光，使单色光连续地依次通

过溶液，并测得该溶液对每一波长的吸收，得到吸收光谱曲线。

 吸收光谱来源于物质对光的选择吸收，这是物质的宏观现象，而吸收的本质

是分子内部运动和光相互作用的结果。当物质的分子吸收一定能量或波长的光谱

后，透过的光谱中有些波长被吸收就形成了吸收光谱。吸收的能量愈小，则相应

的光的波长，吸收峰出现在较长波段。当吸收在红外区时形成红外吸收光谱，如

果吸收能量愈大，则相应的波长愈短，吸收峰出现在较短波段，当吸收在紫外区

产生紫外吸收光谱。

2）吸收定律—朗伯比耳定律：当一束平行单色光通过均匀的溶液时，其吸光度

与溶液的浓度和厚度的乘积成正比。

其数字表达式：A=KCL=LogI0/I=-LogT

吸收定律数字表达式成立的前提：①，入射光为单色光，②，吸收过程中各

物质无相互作用，各物质吸光度具有加和性，③，光与物质的作用仅限于吸收过

程，没有荧光散射和光化学现象，④，吸收物是一种均匀分布的连续体系，

3）影响分光光度法的原因：

a，辐射与物质的非吸收作用引起的误差，

b，荧光与光化学反应的影响，一般说来，荧光对分光光度测量产生的误差

可以忽略，多数情况下显色体系的荧光效率很小，而且荧光发射是各向同性，只

有一小部分沿着透射光方向进入检测器，使测量吸光度偏低，产生负偏离。荧光

 对吸收测量的影响极大程度上决定于仪器的吸收池和检测器光学设计，

 c，反射和散射，吸收定律只适用于均匀介质的吸收体系，浑浊溶液因散射

使实测吸光度增加，导致偏离比耳定律，

d，仪器的非理想性引起的误差，

 e，复色光对比耳定律的偏离，大多数光度计只能获得接近于单色光的狭窄

的光通带，实际上仍是有复色光性质，可导致偏离比耳定律。偏离的大小取决于

二单色光的摩尔吸光系数差△ε，|△ε|很小时，可近似认为是单色光，在低浓

度时，工作曲线仍为直线，但浓度较大时，随浓度增大，A-C曲线弯曲愈严重，

故比耳定律只适用于稀溶液，

f 杂散光，杂散光是指进入检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的不需要

的其它波长组分。其主要来源于分光光度计色散元件棱镜或光栅、反射镜、透镜

表面的散射，单色器内壁灰尘及其它元件伤痕的反射和漫射等，杂散光可引起严

重的测量误差。在仪器能量处于最小的波长处，杂散光通常处于最大值（如氘灯

220nm,钨灯 340nm），

g，狭缝宽度，狭缝宽度不仅影响光谱的纯度，也影响吸光度值。在定量分

析时，为了得到足够的测量信号，应采用较大的狭缝，在定性分析时则采用较小

的狭缝，当出射狭缝和入射狭缝的宽度相等时，狭缝宽度引起的误差最小，

 h，波长标度尺的误差，波长标度尺即仪器的波长准确度，如误差较大或未

作校正，将光谱测量产生误差，即影响吸光度测量的准确度（在吸收光谱的尖峰

处更为显著），

 i，不平行入射光的影响，比耳定律的前提条件之一是采用平行入射光束，

以保证全部光束通过同一厚度的吸收介质，当入射光束偏离平行性较大时，就明

显导致偏离比耳定律。如果仪器中光束中等强度偏离平行性，引起的吸光度测量

误差一般在 0.5%以内；

j，光度标尺的误差，光度标尺即透射比准确度，其误差大小直接影响光度

测量的准确度。

2、性能指标释义

 1）光学系统：通常是指光学系统的结构形式，目前，国际国内光度计行业常采

用的机构为自准式和 CT式两种结构；

 2）波长范围：指光度计所能进行测试的波长最大值和最小值之差；

 3）波长准确度 仪器显示波长与真实波长的接近程度，即仪器设定波长与实际波

 长的差值。每台光度计都要在很多个波长点检查波长准确度；波长准确度是分光

 光度计的一项重要技术指标，它对定性、定量及结构分析结果影响极大。

 4）波长重复性：波长重复性是仪器返回原波长的能力。它体现了波长驱动机械

和整个仪器的稳定性；

 5）光谱带宽（灵敏度，分辨力）：指一个尖峰光谱带通过单色器出狭缝时，在检

 测器上所检测到的能量半宽度，用波长单位 nm 表示，从另一个角度理解这一概

 念会更通俗易懂：首先，单色器出狭缝不仅仅代表着狭缝的物理尺寸或几何尺寸，

 他还代表着光学意义，这就是光谱带宽，我们知道，来自单色器的光线不全是单

 一波长的光，而是一个狭窄的按波长大小顺序排列的光谱带，这一光谱带包含波

 长的多少，用光谱带宽来表示。光谱带宽直接反应的是从单色器出来的光的单色

 性的好坏程度。该指标与仪器的分辨力和灵敏度很相似，但又有所不同，他们从

 不同的侧面反应光度计性能的好坏。分辨力是指仪器分辨两相邻波长大小的能

力，

 灵敏度是指在做低浓度测量时，当浓度改变一个单位时在检测器上所引起信号的

 变化量，它受校正曲线（标准曲线浓度为横轴，吸光度为纵轴）和仪器本身精密

 度的限制。两种测量方法精密度相同时，校正曲线斜率越大越灵敏，而斜率相等

 时，精密度越高灵敏度越好。需要指出的是，为了得到准确的测试结果，仪器的

光谱带宽（Spectral Bandwith 简称 SBW）和分析样品的自然带宽（Natural

 Bandb 简称 NBW）之比应小于 0.1 , 这样可以得到 99.5% 以上的测量准确

 度。

 6）杂散光：杂散光是非选择波长的光照射到检测器上产生的信号。它是光度计

分析误差的一个重要来源，杂散光大会限制高浓度溶液分析的准确性。杂散光用

T%表示；

 7）光度范围：指光度计在满足各项技术指标下的测试范围，用 A或 T表示；

 8）光度准确度：指多次测定的平均值与真实值符合的程度；检查光度准确度，

通常是利用经过仔细反复测量的中性滤光片作为标准光度片来检测的。中性滤光

片是一种对一定波长范围内的光具有几乎相同的透射比（或吸光度）的滤光片，

利用它对波长变化及带宽变化不敏感的特性，来检查仪器的光度准确度和重复

性。